Nova Biologica Reperta
یافته های نوین در علوم زیستی
NBR
Basic Sciences
http://nbr.khu.ac.ir
1
admin
2423-6330
2476-7115
10.52547/nbr
en
jalali
1395
9
1
gregorian
2016
12
1
3
3
online
1
fulltext
fa
ایجاد جهش نقطه ای در اسید آمینۀ 263 ژن استرپتوکیناز و کلونینگ و بیان پروتئین جهش یافتۀ حاوی سیستئین
Point mutation in amino acid 263 of streptokinase gene as well as cloning and expression of the cysteine containing mutated protein
ژنتیک
Genetics
مقاله پژوهشی
Original Article
<p><span dir="RTL">استرپتوکیناز یکی از شناخته ­شده ­ترین عوامل ترومبولیتیک با مصرف بالینی گسترده است. با وجود</span> <span dir="RTL">این</span><span dir="RTL">، کاربرد آن به­ دلیل ایمونوژن</span> <span dir="RTL">بودن، ایجاد عوارض هموراژیک</span> <span dir="RTL">و نیمۀ</span>­<span dir="RTL">عمر نسبتاً کوتاه، همراه با خطرهایی است.</span><span dir="RTL"> پگیلاسیون اختصاصی بر روی اسیدآمینۀ سیستئین، تکنیکی مفید جهت کاهش بسیاری از این عوارض است. هدف از مطالعۀ حاضر، طراحی و تولید مولکول استرپتوکیناز جهش ­یافتۀ حاوی سیستئین است که برای پگیلاسیون اختصاصی قابل­ استفاده باشد. اسیدگلوتامیک 263 استرپتوکیناز، که یک اسیدآمینۀ سطحی در ساختار پروتئین استرپتوکیناز است، برای انجام جهش و تعویض با سیستئین انتخاب­شد. برای نیل به این هدف، با به­ کارگیری روش </span>SOEing PCR<span dir="RTL">، جهش بر روی کدون </span>GLU263<span dir="RTL"> ژن استرپتوکیناز برای تبدیل به کدون سیستئین انجام شد. سپس، ژن استرپتوکیناز دست ­نخورده و جهش­ یافته در وکتور بیانی </span>pET-26b (+)<span dir="RTL"> وارد شدند. ساختارهای حاصل درون </span><em><span dir="RTL">اشریشیا کلی</span></em> Rosetta (DE3)<span dir="RTL"> ترنسفرم شده و توسط القا با </span>IPTG<span dir="RTL"> بیان شدند. درنهایت، تولید پروتئین­ ها به­ وسیلۀ آزمون­ های </span>SDS-PAGE<span dir="RTL"> و وسترن بلاتینگ تأیید شد. پروتئین­ ها به­ وسیلۀ افینیتی کروماتوگرافی با ستون </span>Ni-NTA agarose<span dir="RTL"> در شرایط دناتوره با اوره تخلیص شدند و برای حذف اوره و تاخوردگی مجدد پروتئین­ ها از فیلتراسیون ژلی با سفادکس </span> G-25<span dir="RTL">استفاده شد. نتایج این مطالعه نشان داد که با استفاده از وکتور و میزبان مذکور ژن جهش­ یافتۀ حاوی کدون سیستئین به­ خوبی بیان می ­شود و برای پگیلاسیون اختصاصی مناسب خواهد بود.</span></p>
<p>Streptokinase is one of the best known thrombolytic agents with widespread clinical use. However, its use is not risk-free due to its immunogenicity, hemorrhagic complications and relatively short half-life in circulation. Specific PEGylation of cysteine residue is a useful technique for reducing most of these complications. The aim of this study was designing and producing a cysteine containing mutant of streptokinase, to be used for specific PEGylation. Glut-amic acid 263, which is a surface amino acid in the structure of streptokinase protein, was selected for replacement with cysteine amino acid by site directed mutagenesis. The Glu263 codon was changed to cysteine codon by SOEing PCR technique. Then, the intact and mutated streptokinase genes were inserted into expression vector pET-26b (+). The co-nstructs were transformed to <em>Escherichia.coli </em>Rosetta (DE3) strain and the proteins were expressed by IPTG induction. The proteins were confirmed by SDS-PAGE and western blot analysis, purified by Ni-NTA agarose affinity chroma-tography under denaturing condition with urea and Sephadex G-25 column was applied to remove urea to refold the pr-oteins. This study indicated that by using aforesaid vector and host, cysteine containing mutant gene is expressed well and it will be appropriate for specific PEGylation.</p>
ترومبولیتیک, پگیلاسیون, اسید گلوتامیک, تخلیص
thrombolytic, PEGylation, glutamic acid, purification
258
268
http://nbr.khu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-81-23&slc_lang=fa&sid=1
Mahsa
Rezaee
مهسا
رضایی
10031947532846008754
10031947532846008754
No
دانشگاه آزاد واحد پیشوا ورامین
Fahimeh
Baghbani Arani
فهیمه
باغبانی آرانی
10031947532846008755
10031947532846008755
No
دانشگاه آزاد واحد پیشوا ورامین
Reza
Arabi Mianroodi
رضا
عربی میانرودی
10031947532846008756
10031947532846008756
Yes
انستیتو پاستور